Bir floresans filtresi, floresans mikroskobunun önemli bir bileşenidir. Tipik bir sistemin üç temel filtresi vardır: bir uyarma filtresi, bir emisyon filtresi ve bir dikroik ayna. Genellikle bir küp içinde paketlenirler, böylece grup birlikte mikroskoba yerleştirilir.
Floresan filtre nasıl çalışır?
Uyarma Filtresi
Uyarma filtreleri belirli bir dalga boyundaki ışığı iletir ve diğer dalga boylarını engeller. Filtreyi yalnızca bir rengin geçmesine izin verecek şekilde ayarlayarak farklı renkler üretmek için kullanılabilirler. Uyarma filtreleri iki ana tipte gelir; uzun geçişli filtreler ve bant geçişli filtreler. Uyarıcı genellikle yalnızca florofor tarafından absorbe edilen dalga boylarını geçiren bir bant geçiren filtredir, böylece diğer floresans kaynaklarının uyarılmasını en aza indirir ve floresans emisyon bandında uyarım ışığını bloke eder. Şekilde mavi çizgiyle gösterildiği gibi BP 460-495'tir, bu da yalnızca 460-495nm floresanstan geçebileceği anlamına gelir.
Bir floresan mikroskobunun aydınlatma yolu içine yerleştirilir ve florofor uyarma aralığı dışında ışık kaynağının tüm dalga boylarını filtreler. Filtrenin minimum iletimi, görüntülerin parlaklığını ve parlaklığını belirler. Herhangi bir uyarma filtresi için minimum %40 iletim önerilir, böylece iletim ideal olarak >%85 olur. Uyarma filtresinin bant genişliği, filtrenin merkez dalga boyu (CWL) floroforun tepe uyarma dalga boyuna mümkün olduğu kadar yakın olacak şekilde tamamen florofor uyarma aralığı içinde olmalıdır. Uyarma filtresi optik yoğunluğu (OD), arka plan görüntüsünün koyuluğunu belirler; OD, bir filtrenin iletim aralığı veya bant genişliği dışındaki dalga boylarını ne kadar iyi engellediğinin bir ölçüsüdür. Minimum 3,0 OD önerilir ancak 6,0 veya daha büyük bir OD idealdir.
Emisyon Filtresi
Emisyon filtreleri, numuneden istenen floresansın dedektöre ulaşmasına izin verme amacına hizmet eder. Daha kısa dalga boylarını bloke ederler ve daha uzun dalga boyları için yüksek geçirgenliğe sahiptirler. Filtre tipi aynı zamanda bir sayıyla da ilişkilidir, örneğin şekildeki BA510IF (girişim bariyer filtresi), bu tanımlama maksimum iletiminin %50'sindeki dalga boyunu ifade eder.
Uyarma filtreleri için aynı öneriler emisyon filtreleri için de geçerlidir: minimum iletim, bant genişliği, OD ve CWL. İdeal CWL, minimum iletim ve OD kombinasyonuna sahip bir emisyon filtresi, mümkün olan en derin engellemeyle mümkün olan en parlak görüntüleri sağlar ve en zayıf emisyon sinyallerinin algılanmasını sağlar.
Dikroik Ayna
Dikroik ayna, uyarma filtresi ile emisyon filtresi arasına 45° açıyla yerleştirilir ve emisyon sinyalini dedektöre iletirken uyarma sinyalini florofora doğru yansıtır. İdeal dikroik filtreler ve ışın ayırıcılar, uyarma filtresinin bant genişliği için >%95 yansıma ve emisyon filtresinin bant genişliği için >%90 iletme ile maksimum yansıma ve maksimum iletim arasında keskin geçişlere sahiptir. Kaçak ışığı en aza indirmek ve floresan görüntü sinyali-gürültü oranını en üst düzeye çıkarmak için, floroforun kesişim dalga boyunu (λ) göz önünde bulundurarak filtreyi seçin.
Bu şekildeki dikroik ayna DM505'tir, bu şekilde adlandırılmıştır çünkü 505 nanometre bu ayna için maksimum iletimin %50'sindeki dalga boyudur. Bu aynanın iletim eğrisi 505 nm'nin üzerinde yüksek iletim, sol tarafa doğru iletimde 505 nanometrelik dik bir düşüş ve 505 nanometrenin soluna doğru maksimum yansıma gösterir ancak yine de 505 nm'nin altında bir miktar iletim olabilir.
Uzun geçişli ve bant geçişli filtreler arasındaki fark nedir?
Floresan filtreler iki türe ayrılabilir: uzun geçişli (LP) ve bant geçişli (BP).
Uzun geçiş filtreleri uzun dalga boylarını iletir ve kısa olanları engeller. Kesme dalga boyu, en yüksek iletimin %50'sindeki değerdir ve kesmenin üzerindeki tüm dalga boyları, uzun geçiş filtreleri tarafından iletilir. Dikroik aynalarda ve emisyon filtrelerinde sıklıkla kullanılırlar. Uygulama maksimum emisyon toplamayı gerektirdiğinde ve spektral ayrım istenmediğinde veya gerekli olmadığında uzun geçişli filtreler kullanılmalıdır; bu genellikle nispeten düşük arka plan otofloresansı seviyelerine sahip numunelerde tek bir yayıcı tür üreten problar için geçerlidir.
Bant geçiren filtreler yalnızca belirli bir dalga boyu bandını iletir ve diğerlerini engeller. Florofor emisyon spektrumunun yalnızca en güçlü kısmının iletilmesine izin vererek karışmayı azaltır, otofloresan gürültüsünü azaltır ve böylece uzun geçişli filtrelerin sunamayacağı yüksek arka plan otofloresan örneklerinde sinyal-gürültü oranını iyileştirir.
BestScope kaç çeşit floresan filtre seti sağlayabilir?
Bazı yaygın filtre türleri arasında mavi, yeşil ve ultraviyole filtreler bulunur. Tabloda gösterildiği gibi.
| Filtre Seti | Uyarma Filtresi | Dikroik Ayna | Bariyer Filtresi | LED lamba Dalga Boyu | Başvuru |
| B | BP460-495 | DM505 | BA510 | 485nm | ·FITC: Floresan antikor yöntemi · Asidin portakalı: DNA, RNA · Auramin: Tüberküloz basili ·EGFP, S657, RSGFP |
| G | BP510-550 | DM570 | BA575 | 535nm | ·Rodamin, TRITC: Floresan antikor yöntemi ·Propidium iyodür: DNA ·RFP |
| U | BP330-385 | DM410 | BA420 | 365nm | ·Oto-floresan gözlemi ·DAPI: DNA boyama ·Hoechest 332528, 33342: Kromozom boyama için kullanılır |
| V | BP400-410 | DM455 | BA460 | 405nm | ·Katekolaminler ·5-hidroksi triptamin ·Tetrasiklin: İskelet, Diş |
| R | BP620-650 | DM660 | BA670-750 | 640nm | ·Cy5 ·Alexa Fluor 633, Alexa Fluor 647 |
Floresan elde etmede kullanılan filtre setleri, en çok kullanılan floroforları temel alan, floresans uygulamalarında kullanılan ana dalga boylarına göre tasarlanmıştır. Bu nedenle DAPI (mavi), FITC (yeşil) veya TRITC (kırmızı) filtre küpleri gibi görüntüleme amaçlı oldukları florofordan sonra da adlandırılırlar.
| Filtre Seti | Uyarma Filtresi | Dikroik Ayna | Bariyer Filtresi | LED lamba Dalga Boyu |
| FITC | BP460-495 | DM505 | BA510-550 | 485nm |
| DAPI | BP360-390 | DM415 | BA435-485 | 365nm |
| TRİK | BP528-553 | DM565 | BA578-633 | 535nm |
| FL-Auramin | BP470 | DM480 | BA485 | 450nm |
| Teksas Kırmızısı | BP540-580 | DM595 | BA600-660 | 560nm |
| mCherry | BP542-582 | DM593 | BA605-675 | 560nm |
Floresan filtreyi nasıl seçersiniz?
1. Floresan filtreyi seçme ilkesi, en yüksek sinyal-gürültü oranını elde etmek için floresans/emisyon ışığının görüntüleme ucundan mümkün olduğu kadar geçmesine izin vermek ve aynı zamanda uyarma ışığını tamamen bloke etmektir. Özellikle çok fotonlu uyarım ve toplam iç yansıma mikroskobunun uygulanması için, zayıf gürültü aynı zamanda görüntüleme etkisinde de büyük bir girişime neden olacaktır, bu nedenle sinyal-gürültü oranı gereksinimi daha yüksektir.
2. Floroforun uyarılma ve emisyon spektrumunu bilir. Siyah bir arka plana sahip, yüksek kaliteli, yüksek kontrastlı bir görüntü üreten bir floresan filtre seti oluşturmak için, uyarma ve emisyon filtreleri, florofor uyarma tepe noktalarına veya emisyonlara karşılık gelen bölgeler üzerinde minimum geçiş bandı dalgalanmasıyla yüksek iletim sağlamalıdır.
3. Floresan filtrelerin dayanıklılığını göz önünde bulundurun. Bu filtreler, özellikle aydınlatma kaynağının tam yoğunluğuna maruz kalan uyarıcı filtrede "tükenmeye" yol açabilecek ultraviyole (UV) ışık üreten yoğun ışık kaynaklarına karşı dayanıklı olmalıdır.
Farklı Floresan Örnek Görselleri
Kaynaklar internette toplanır ve düzenlenir ve yalnızca öğrenme ve iletişim için kullanılır. Herhangi bir ihlal varsa, silmek için lütfen bizimle iletişime geçin.
Gönderim zamanı: Aralık-09-2022